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羊肚菌培育知识

 

 

(四川绵阳市食用菌研究所种植模式)

 

 

 

 

 

鲁山赵村中汤新村

 

 

李国强

 

2013-1-21

 

 

羊肚菌的裁培技术

一、PDA培养基的制作

（一）所需材料

1、器材：电磁炉（液化气炉） 量杯 刀 切菜板 不锈钢锅 筛箕等

2、原料配方（1倍量即70至80支试管左右）

土豆250克（含皮，如去皮即200克）   琼脂20克    

维生素B₁ 2片（每片10毫克）        口服葡萄糖20克

蛋白胨3—5克       清水1000毫升（指熬煮好后的量，因在熬煮的过程中会蒸发水份，所以在实际操作中要多加400—500毫升）

（二）制作过程

1、土豆清水洗净——去皮——清水洗净——切成大小均匀的小丁（土豆一定要洗净，否则煮汁后的杂质，影响后期的观察；土豆切丁大小要均匀，不然煮熟程度会不一致；选择土豆是要注意，要选新鲜的，不要选择已发芽的及被太阳晒过有绿皮的）。

2、将切好的土豆丁放入洗净的不锈钢锅中——加入1300—1400毫升的清水——开火煮（先猛火，煮沸后改文火，煮沸后要注意搅拌，以防糊锅）——煮至土豆丁熟而不烂即停火（即用手捏土豆丁即粉碎，但所捏土豆丁的形状与未煮前的形状未有任何变化的为好）。

3、将煮好的土豆及汁液倒入筛箕（垫上纱布或用滤网、毛巾）过滤取汁（过滤的土豆汁无杂质，接近透明为佳，经过第一次煮，水份为蒸发100-200毫升）——将不锈钢锅刷净——倒入过滤好的土豆汁——加入琼脂20克，维生素B₁ 2片（每片10毫克），口服葡萄糖20克，蛋白胨3—5克（加入这些原料的顺序不分先后）——开火熬煮（注意要边熬边搅拌，以防糊锅；先猛火，煮沸后改文火；熬煮过程中如水份蒸发过多，中途可加适量的水补充）——熬煮至锅内的琼脂全部融化即可停火（锅内绝大部份琼脂融化即可），即成培养基。

4、将熬煮好的培养基趁热装入180ｘ18mm规格的试管中，灌装的量以达试管总量的四分之一（1/4）为宜（不能灌装过多；事先要洗净试管并晾干，准备好导管及2个死水夹，装试管时导管最好伸入试管中部再打开死水夹注入培养基，以防培养基粘到试管口，如培养基粘到试管口须用干净的布擦净）。灌装好后将试管呈一定角度斜立放（利于散热，试管口朝上），在室温下静置4—5个小时，使培养基凝固。

（要趁热尽快灌装，否则培养基冷却后会凝固，如有条件可将熬煮好的培养液装入保温桶（壶）中可延长灌装时间。）

5、将装有已凝固的培养基试管用普通棉花做成棉花塞塞紧试管口（塞入试管1-1.5cm深度为宜，用普通棉花，不得用脱脂棉花；塞试管时一定要塞紧，宜紧不宜松）。

6、高温高压灭菌：将塞好棉花塞的试管(试管口朝上)直立放入高压灭菌锅的同胆里（量少的要放入其他物品填充，确保试管直立着），在高压灭菌锅内加入清水至与锅底的三个支脚的上部齐平即可，放入已装好试管（装有培养基）的锅胆，盖上锅盖，拧紧螺旋（注意要对角拧，不然会漏气），关闭各气压阀——将高压灭菌锅放上火炉，开火加热（或通电加热）——等高压锅上压力表指针指到0.05mpa时,找开低压阀(冷气阀)排泻锅内冷气(使锅内受热均匀)30-40秒(即当压力表指针指到0.01-0.02mpa即可)，并闭低压阀(或冷气阀，注意在排泻冷气时不能熄火，要继续加热。)——继续加热——等高压锅压力表指针指到0.15mpa时开始计时，注意调节火力大小，保持锅内0.15mpa压力90分钟方可停火。（指针指到0.15mpa时，用通过调节火力保持0.15mpa压力90分钟）

高压灭菌锅加热灭菌过程要有人值守，防止小孩靠近，注意安全操作！

7、停火后让高压灭菌锅自然冷却（压力表指针归零），打开排气阀——拧开螺旋，开锅——取出装有培养基的试管——斜着放在事先做好的呈1cm垂直落差的平台上（先试管底放在平台上，试管口朝上，斜放），即摆成斜面，使试管内的培养基也呈斜面，注意在摆斜面的过程中，一定要让试管底先着平台面，再轻轻将试管口靠在较高的平台边上，一定不能让培养基粘到棉花塞，一旦粘着即要作废，不能再用！

8、摆好呈斜面的培养基放置在常温下7—10天（注意室内要通风，温、湿度不限），让试管内水份全部蒸发后方可进行母种克隆或转管扩繁。在常温下，经灭菌后的培养基可放置3个月左右。即在确定好克隆或转管前至少提前一周制作好培养基。

注意：高压灭菌时间宜长不宜短；用棉花塞试管宜紧不宜松（一般捏着露在试管口外的棉花能将整个试管提起即可）；培养基在高温灭菌前呈乳白色，灭菌后会变成深黄色。

二、母种克隆分离（组织分离）技术

（一）母种的采集

1、应选择野生羊肚菌作为母种进行克隆（当地野生羊肚菌易适应当地气候环境、繁殖及抗病害能力强、代数少基因稳定、品质优等）

2、选择优质、健康野生菌种：整株长度在10-12cm、菌帽达整株长度2/3为好，不要过小或刚长出来的，也不要选择过大、老化的（菌帽很开的）；颜色偏黄（嫩黄）、尖顶的为佳；畸形、破损的不能用。

注意：光照过多羊肚菌偏黑色，有时秋天也会出一批菌；一般在2-4月进行野生菌采集并及时克隆分离。

3、采集方法：一手轻捏野生羊肚菌菌脚，用小铲奖整株羊肚菌边同菌脚周围的泥土一起铲起，用保鲜膜（袋）将菌脚及泥土包住（切记不能包到菌帽，也不能包得太紧，包住的目的是不让水份挥发过快），包好后及时带回家进行克隆分离。如不马上进行克隆，须将其放入冰箱冷藏室内保存（3—8℃），可保存一周左右。

取回过程中可将其放在周围放有冰块（冰水瓶）的保温盒（容器）中。

4、利用野生羊肚菌各部分组织进行克隆的优劣

（1）菌脚：菌丝多、易萌发，但易染，用时要注意用手握住菌脚，轻轻抖掉菌脚上的泥土（如果菌脚带泥过多），亦可用干净的小毛刷轻轻刷掉一些粘在菌脚上的泥土，也可不理会这些泥土。

  （2）菌柄、菌帽：含杂菌少、受感染率低，但萌发率低。

注意：

另有一种极为少见的情况：在采集野菌种时，会有个别羊肚菌菌的脚处长有一根很长很粗的、由菌丝纽结在一起形成的菌丝纽结带，可将其连同其周围的泥土取回，克隆时轻轻弄去附在其周围的泥土，剪成小断即可用其进行克隆，克隆成功率会很高。

对采集回来的用于克隆的野生羊肚菌菌种，绝不能用清水洗或者用酒精、紫外灯对其进行消毒，否则会杀死菌种孢子。

（二）组织克隆

1、所需器物：

托盘 培养皿 小刀（或小剪刀） 镊子  接种钩 酒精灯 不锈钢小碗（陶瓷/玻璃材质的均可，不能是朔料材质） 打火机  经高温高压灭菌的空白培养基 接种箱 75%酒精 普通棉花 95%酒精（酒精灯用）甲醛（浓度为37-40%）  高锰酸钾   野生羊肚菌

2、器具消毒

（1）用75%的酒精对操作者的手、托盘、培养皿、小刀（或小剪刀） 镊子、接种钩、酒精灯、打火机进行擦拭消毒。

（2）将以上经75%酒精擦拭消毒的托盘、培养皿、小刀（或小剪刀） 镊子、 接种钩、酒精灯、打火机及连同不锈钢小碗、空白培养基、采集回来用于克隆的野生羊肚菌菌种放入接种箱。（将羊肚菌菌种放入培养皿，将培养皿、小刀、镊子、接种钩放入托盘）

（3）在不锈钢小碗内倒入3-5ml的甲醛、再加入3-5克的高锰酸钾（一定要先倒甲醛后加高锰酸钾，甲醛浓度37—40%），立即关好密封好（封口胶）接种箱，消毒30-40分钟。

如有条件，在人、菌种未进入操作室前，可用紫外线灯提前12小时对操作室进行消毒（人及菌种绝不能进入）；接种钩可自制（打毛线针制作）。

第一次(初次)使用接种箱时(新接种箱),需在使用前3-4小时用75%酒精对箱体内部进行擦拭消毒(第一次用完之后可不再如此消毒)

    3、克隆操作

（1）经30-40分钟的消毒后，用棉花团浸75%的酒精对双手（手腕、手心、手背、指丫、指甲—带酒精棉花团拍打指甲）进行擦拭消毒，并将此棉花团带入接种箱，用其擦拭接种钩、镊子、小刀、打火机，用打火机点燃酒精灯，然后将接种钩、镊子、小刀分别放在酒精灯上烤3-5秒钟（用酒精灯外焰烤），如烤后温度过高，须放冷却后再用。

（2）经消毒、烤炙后，用镊子夹住放置在培养皿中的菌种，另一手执小刀将菌种（菌脚、帽、柄）切成黄豆粒般大小的小块（可稍大些），注意手不能接触菌体。

（3）切好菌体组织后,左手执装有空白培养基的试管(培养基斜面朝上),右手用旋转棉花塞的方式打开试管(即取下棉花塞),然后用接种钩将切好的菌体组织黄豆般大小的一小块放入试管内培养基的斜面的中部位置,再用旋转棉花塞方式将试管塞好,并将试管平放在接种箱内(注意要培养基斜面朝上)。依此方法接好其他试管。

（4）全部试管装好后，熄灭酒精灯，将接好种的试管放置在接种箱内5-6分钟后，打开接种箱，取出所有物器及试管（接好种的试管要平着取出），将接好种的试管置于常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃）平放于平台上（培养基斜面朝上）。

4、菌丝生长情况的观察、取舍及母种的保存

（1）一般情况，接种好的试管在常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃），2-3天后克隆体会开始萌发菌丝，7-10天后（温度高会快些）菌丝会长满管（长满试管，即培养基上均布有菌丝），长满管后即可将其放入冰箱冷藏室内（3-8℃）保存（最好用报纸包扎好试管口再放入冰箱），如此可存放3个月，超过3个月，羊肚菌菌丝活力会咸弱，并会慢慢退化。

注意：在接好种至菌比长满管期间（2—10天内），必须每天都要观察各试管内菌丝萌发、生长情况，一旦发现有杂菌感染的试管，必须立即取出作废掉，如某支试管一时难以判断的，不得将其与正常试管混在一起，取出单独存放，待时间长些在观察酌情处理。

（2）羊肚菌菌丝萌发及生长特点：

①正常情况下，羊肚菌菌丝会在接种后的第2-3天开始萌发，杂菌则会在第3-4天才开始萌发，即杂菌菌丝萌发的时间会稍晚些。

②羊肚菌的菌丝先是挨着（贴着）培养基长的，等长满管后，菌丝会开始沿着试管壁长。

③羊肚菌的菌丝是往两边长的，是斜着长的，菌丝呈现树状（  ）

④羊肚菌菌丝的颜色不是纯白的，是偏米黄色的（即带点黄色），在一定温度下（20℃以上），菌丝会长出（退化成）菌核（有时也不一定会长菌核）——白色或黄色小颗粒。

⑤杂菌菌比的特点：坚直生长，有的发绿、发黑或发白（有的会像石灰撒在培养基面上）；有的会在试管口处生长或棉花塞上生长；杂菌感染的试管培养基边沿会呈白色，或者培养基面会呈现脓状，或者培养基面会有一层不透明的膜状物等。（试管口棉花塞上有发黑、发绿的，要处理掉，不在培养基上生长的可能有杂菌感染）

⑥温度过高时，试管内的培养基会呈黑色，此属正常现象，有时正常羊肚菌菌丝还会生出“气生菌丝”(白似雪的菌丝)要注意判断。

⑦会感染的主要有根霉、绿霉（像癣）、白霉等

野生羊肚菌实体克隆（组织分离）出一代母种的功率为5%左右，故要注意克隆量。

5、作废试管的处理及清洗

如接好种的试管受杂菌感染，必须立即处理掉，取下试管上的棉花塞（可重复使用），将试管放入盛有清水的盒水浸泡片刻，轻甩试管即可甩出试管内的物质，再用试管刷将试管刷洗干净，清水冲洗，管口朝上置放，待水干后即可收起或使用。

三、母种转管扩繁

1、所需器物：

要提前制作好培养基（空白培养基，方法同母种克隆）并经高温灭菌后在常温下放置有一周以上（急时亦可在做克隆母种时多做些培养基备用亦可）；有克隆好的一代母种

一代母种羊肚菌、托盘  接种钩 酒精灯 不锈钢小碗（陶瓷/玻璃材质的均可，不能是朔料材质） 打火机  经高温高压灭菌的空白培养基 接种箱  75%酒精 普通棉花  95%酒精（酒精灯用） 甲醛（浓度为37-40%）  高锰酸钾

2、器具消毒

（1）用75%的酒精对操作者的手、托盘、接种钩、酒精灯、打火机及装有一代母种的试管进行擦拭消毒（装有一代母种的试管用浸有75%酒精的棉花团擦拭试管外避及旋转擦拭母种试管的棉花塞——尽量浸湿，注意要竖直擦拭消毒）。

（2）将以上经75%酒精擦拭消毒的托盘、接种钩、酒精灯、打火机、一代母种及连同不锈钢小碗、空白培养基放入接种箱。（将一代母种、接种钩放入托盘）

（3）在不锈钢小碗内倒入3-5ml的甲醛、再加入3-5克的高锰酸钾（一定要先倒甲醛后加高锰酸钾），立即关好密封好（封口胶）接种箱，消毒30-40分钟。

如有条件，在人、菌种未进入操作室前，可用紫外线灯提前12小时对操作室进行消毒（人及菌种绝不能进入）。

3、转管操作

（1）经30-40分钟的消毒后，用棉花团浸75%的酒精对双手（手腕、手心、手背、指丫、指甲—带酒精棉花团拍打指甲）进行擦拭消毒，并将此棉花团带入接种箱，用其擦拭接种钩、打火机，用打火机点燃酒精灯，然后将接种钩放在酒精灯上烤3-5秒钟（用酒精灯外焰烤），如烤后温度过高，须放冷却后再用。

（2）左手同时拿起一代母种及空白培养基试管（培养基斜面朝上），有旋转棉花塞的方式分别打开各试管（注意棉花塞不能混用），用接种钩从母种管内取出黄豆般大小并已长有羊肚菌菌丝的培养基放入盛有空白培养基的试管中（放在空白培养基斜面的中部位置），然后将接好种的试管塞用原来的棉花塞塞好（旋转方式），平放在接种箱内一侧。即可再拿起其他空白培养基试管进行接种（方法同上，即从母种管取出黄豆般大小带菌丝培养基放入空白培养基管中，再塞上原来棉花塞，平放箱内），直至接完为止。

（3）全部试管装好后，熄灭酒精灯，将接好种的试管放置在接种箱内5-6分钟后，打开接种箱，取出所有物器及试管（接好种的试管要平着取出），将接好种的试管置于常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃）平放于平台上（培养基斜面朝上）。

4、菌丝生长情况的观察、取舍及母种的保存

（1）一般情况，接种好的试管在常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃），2-3天后开始萌，7-10天后（温度高会快些）菌丝会长满管（长满试管，即培养基上均布有菌丝），长满管后即可将其放入冰箱冷藏室内（3-8℃）保存（最好用报纸包扎好试管口再放入冰箱），如此可存放3个月，超过3个月，羊肚菌菌丝活力会咸弱，并会慢慢退化。

注意：在接好种至菌比长满管期间（2—10天内），必须每天都要观察各试管内菌丝萌发、生长情况，一旦发现有杂菌感染的试管，必须立即取出作废掉，如某支试管一时难以判断的，不得将其与正常试管混在一起，取出单独存放，待时间长些在观察酌情处理。

（2）羊肚菌菌丝萌发及生长特点（与母种克隆情况相同，参见母种克隆部分）

转管扩繁（即一代母种克隆二代母种）的功率为95%左右，一般一支一代母种可转得30支二代母种。

5、作废试管的处理及清洗（参见母种克隆部分）

注意：在转管时，最好将一代母种培养基最前面那薄薄的一层去掉不要，因为其接近棉花塞，有可能会被感染，且其虽有菌丝，但转管后它萌发慢，所以尽量取长有菌丝的培养基表面。

★野生羊肚菌菌种实体——克隆分离——接入培养基得一代母种——转管扩繁——接入培养基得二代母种（如再转管即可三代母种，注意最好只转两至三代，至多不能超过5代，否则菌种会退化）——接入培养料重原种——原种接入培养料得栽培种（原种与栽培种同代）  另：用二或三代母种接入培养料即可二次栽培种

★一支一代母种可接（扩）得30支二代母种（二代母种亦可扩得30支三代种）；一支二代母种可接得3-5瓶原种；一瓶原种可接得30-50瓶栽培种；一支二代母种可接得5-8袋二次栽培种

四、原种、栽培种及二次栽培种的制作

（一）培养料配方（培养料均按100斤量计）

1、原种、栽培种培养料配方：  小麦 77%（不用去皮），麦麸11%（可用米糠代替），土 10%（干土，栽培羊肚菌的土，） ，石灰、石膏各1%（生熟均可）。配方含水量为65%

2、二次栽培种培养料配方：木屑 80%（可用棉籽壳或玉米芯代替，宜用杂木木屑，用阔叶树（落叶树—如杨树、桑树、梧桐树等）木屑、木质疏松的为好，不重用含香油、油汁的松树、樟树、柏树等，不可用木糠代替），麦麸18%（可用米糠代替），石灰、石膏各1%（生熟均可）。配方含水量为65%

另二次栽培种培养料亦可用此配方：栎木屑75%，麦麸20%，石膏各1%，土 4 % 。配方含水量为65%

（二）原种、栽培种培养料的制作

1、按照原种、栽培种培养料配方的要求准备好各种配方原料，先将小麦提前用清水浸泡24小时（温度高时即25℃以上可适当缩短浸泡时间到10-15小时，温度越高浸泡时间越短；小麦不得用霉变的，不用去皮）→滤去浸泡液→倒入锅中（不锈钢）→加入适量清水→开火煮10-20分钟→煮至小麦透心（心无白点）即可。

2、将煮好的小麦过虑去水，倒在地上，摊开冷确，加入配方中的其他配料及适量的清水混合拌均，使其含水量控制在65%（即用手轻捏料团有水渗出指缝而不滴水的状态）→将拌好的培养料装入菌种瓶（事先洗净，晾干，规格为750 ML），松紧适宜（不得过紧或过松）→装培养料至瓶颈收缩处（弧形处），不宜装得太满，要留有一定空间（一般一瓶大概有3两左右，装得过满塞棉花时为粘到棉花）→装好后用布或其他东西将瓶口擦拭干净（以利于后期观察菌丝的生长情况），再用棉花将瓶口塞好（方法与塞试管相同，宜紧不宜松；不能塞得太进，棉花不得粘到培养料）→将装好培养料的菌种瓶竖直放入高压灭菌锅中进行高压灭菌（灭菌方法同克隆或转管时培养基的灭菌方法一样）。

原种量小可用手提高压灭菌锅进行消毒灭菌，量大的如栽培种、二次栽培种则需用大型蒸汽锅炉（需灭菌5小时）或土灶（8小时）或汽油桶（2小时）进行灭菌。注意每层在交叉垒放（码放）在灭菌装置内！

3、灭菌好后的培养料需从灭菌锅（炉或灶）中取出置与常温下让其冷确后方可接种，如不立即使用的，至多可放置一周。

（三）原种的接种

1、所需器物：

提前制作好并经高温灭菌的培养料瓶（菌种瓶）、二或三代母种、托盘、接种钩、酒精灯、不锈钢小碗（陶瓷/玻璃材质的均可，不能是朔料材质）、打火机、接种箱、  75%酒精、普通棉花、95%酒精（酒精灯用）、甲醛（浓度为37-40%）、高锰酸钾

2、器具消毒

（1）用75%的酒精对操作者的手、托盘、接种钩、酒精灯、打火机及装有母种的试管进行擦拭消毒（装有母种的试管用浸有75%酒精的棉花团擦拭试管外壁及旋转擦拭母种试管的棉花塞——尽量浸湿，注意要竖直擦拭消毒）。

（2）将以上经75%酒精擦拭消毒的托盘、接种钩、酒精灯、打火机、母种及连同不锈钢小碗、盛有空白培养料的菌种瓶放入接种箱。（将母种、接种钩放入托盘）

（3）在不锈钢小碗内倒入3-5ml的甲醛、再加入3-5克的高锰酸钾（一定要先倒甲醛后加高锰酸钾），立即关好密封好（封口胶）接种箱，消毒30-40分钟。

如有条件，在人、菌种未进入操作室前，可用紫外线灯提前12小时对操作室进行消毒（人及菌种绝不能进入）。

3、接种操作

（1）经30-40分钟的消毒后，用棉花团浸75%的酒精对双手（手腕、手心、手背、指丫、指甲—带酒精棉花团拍打指甲）进行擦拭消毒，并将此棉花团带入接种箱，用其擦拭接种钩、打火机，用打火机点燃酒精灯，然后将接种钩放在酒精灯上烤3-5秒钟（用酒精灯外焰烤），如烤后温度过高，须放冷却后再用。

（2）用旋转棉花塞的方式分别打开母种试管及空白培养料菌种瓶，用接种钩从母种试管内取出比拇指头稍小（蚕豆般大小）的已长有羊肚菌菌丝的培养基放入盛有空白培养料的菌种瓶（接种瓶）中，然后将接好种的菌种瓶用原来的棉花塞塞好（旋转方式），竖直放在接种箱内一侧后，即可同样方法对其他的空白接种瓶进行接种，直至接完为止。

（3）全部接种瓶均接好后，熄灭酒精灯，将接好种的菌种瓶放置在接种箱内5-6分钟后，打开接种箱，取出所有物器，将接好种的菌种瓶置于常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃）培育20-30天后菌丝即长满瓶。

4、菌丝生长情况的观察、取舍及原种的保存

（1）一般情况，接种好的菌种瓶在常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃），30天后（温度高会快些）菌丝会长满瓶（长满试瓶，即培养料上均布有菌丝），长满瓶后如不立即便用，可将其放入冰箱冷藏室内（3-8℃）保存，如此可存放3个月。

注意：在接好种至菌丝长满瓶期间（20-30天内），最好必须每天都要观察各试瓶内菌丝萌发、生长情况，一旦发现有杂菌感染的，必须立即取出作废掉，如某瓶一时难以判断的，不得将其与正常菌种瓶混在一起，取出单独存放，待时间长些在观察酌情处理。

（2）羊肚菌菌丝萌发及生长特点（与母种克隆情况相同，参见母种克隆部分）

母种接种原种可达100%（主要是看消毒关），一般一支母种可接得3-5瓶原种。

5、作废的菌种瓶要及时处理并及清洗干净。

（四）栽培种的接种

1、所需器物：

按照料制作原种及栽培种培养料的配方、方法提前制作好培养料瓶（用于接种的菌种瓶）、长满瓶的原种、托盘、接种钩（或小勺）、酒精灯、不锈钢小碗（陶瓷/玻璃材质的均可，不能是朔料材质）、打火机、接种箱、75%酒精、普通棉花、95%酒精（酒精灯用）、甲醛（浓度为37-40%）、高锰酸钾

2、器具消毒

（1）用75%的酒精对操作者的手、托盘、接种钩（或小勺）、酒精灯、打火机及原种进行擦拭消毒（装有原种的菌种瓶用浸有75%酒精的棉花团擦拭其外壁并旋转擦拭原种瓶的棉花塞——尽量浸湿，注意要竖直擦拭消毒）。

（2）将以上经75%酒精擦拭消毒的托盘、接种钩、酒精灯、打火机、原种及连同不锈钢小碗、盛有空白培养料的菌种瓶放入接种箱。（将原种、接种钩放入托盘）

（3）在不锈钢小碗内倒入3-5ml的甲醛、再加入3-5克的高锰酸钾（一定要先倒甲醛后加高锰酸钾），立即关好密封好（封口胶）接种箱，消毒30-40分钟。

如有条件，在人、菌种未进入操作室前，可用紫外线灯提前12小时对操作室进行消毒（人及菌种绝不能进入）。

3、接种操作

（1）经30-40分钟的消毒后，用棉花团浸75%的酒精对双手（手腕、手心、手背、指丫、指甲—带酒精棉花团拍打指甲）进行擦拭消毒，并将此棉花团带入接种箱，用其擦拭接种钩、打火机，用打火机点燃酒精灯，然后将接种钩放在酒精灯上烤3-5秒钟（用酒精灯外焰烤），如烤后温度过高，须放冷却后再用。

（2）用旋转棉花塞的方式分别打开原种瓶及盛有空白培养料接种种瓶（棉花塞分开放置，不要混淆），用接种钩从原种瓶内刮取比拇指头大小（可稍大些小即胡豆般大小）的已长有羊肚菌菌丝的培养料放入盛有空白培养料的菌种瓶（接种瓶）中，然后将接好种的菌种瓶用原来的棉花塞塞好（旋转方式），竖直放在接种箱内一侧后，即可同样方法对其他的空白接种瓶进行接种，直至接完为止。

（3）全部接种瓶均接好后，熄灭酒精灯，将接好种的菌种瓶放置在接种箱内5-6分钟后，打开接种箱，取出所有物器，将接好种的菌种瓶置于常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃）培育20-30天后菌丝即长满瓶，栽培种长满瓶后即可播到播种田里。

4、菌丝生长情况的观察、取舍及原种的保存（参见原种接种部分）

原种接种栽培种可达100%（主要是看消毒关），一般一瓶原种可接得30-50瓶栽培种。

5、作废的菌种瓶要及时处理并及清洗干净。

（五）二次栽培种培养料的制作及接种

1、二次栽培种培养料配方：木屑 80%（可用棉籽壳或玉米芯代替，宜用杂木木屑，用阔叶树（落叶树—如杨树、桑树、梧桐树等）木屑、木质疏松的为好，不重用含香油、油汁的松树、樟树、柏树等，不可用木糠代替），麦麸18%（可用米糠代替），石灰、石膏各1%（生熟均可）。配方含水量为65%

2、将干木屑提前用清水浸泡1-2个小时（湿木屑不用泡，如果是用玉米芯或棉籽壳则也不用浸泡），滤去多余水份，将其倒置于地面并加入配方中的其他配料混合拌均，使拌料的含水量控制在65%（即用物捏料团，以指缝间见水而不滴为宜）。→拌好料后即可装袋（聚丙烯菌种袋，规格为12ｘ24cm）,每袋装至12-13cm即可（2-3两重，不可装得太满，要留有一定空间），木屑配方的培养料可适当装紧些。→将装好培养料的栽培袋用细绳子扎好袋口（扎绳处尽量离袋口稍近些，使袋内有一定的空白空间），第一次不要扎得太紧，需打活结 → 将扎好的菌种栽培袋交叉码放（坚直放）在高压灭菌装置内进行高压灭菌（方法同克隆、转管等部分）→灭菌消毒后的栽培袋经冷确后即可进行接种。

3、二次栽培种接种

（1）所需器物：灭菌好的栽培料袋、长满管的二代或三代母种、托盘、接种钩、酒精灯、不锈钢小碗（陶瓷/玻璃材质的均可，不能是朔料材质）、打火机、接种箱、75%酒精、普通棉花、95%酒精（酒精灯用）、甲醛（浓度为37-40%）、高锰酸钾

（2）器具消毒：用75%的酒精对操作者的手、托盘、接种钩（或小勺）、酒精灯、打火机及母种进行擦拭消毒（装有母种的试管用浸有75%酒精的棉花团擦拭其外壁并旋转擦拭试管的棉花塞——尽量浸湿，注意要竖直擦拭消毒）。

（3）将以上经75%酒精擦拭消毒的器物及连同不锈钢小碗、装有空白培养料的菌种袋放入接种箱。（将母种、接种钩放入托盘）

（4）在不锈钢小碗内倒入3-5ml的甲醛、再加入3-5克的高锰酸钾（一定要先倒甲醛后加高锰酸钾），立即关好密封好（封口胶）接种箱，消毒30-40分钟。

如有条件，在人、菌种未进入操作室前，可用紫外线灯提前12小时对操作室进行消毒（人及菌种绝不能进入）。

（5）经30-40分钟的消毒后，用棉花团浸75%的酒精对双手（手腕、手心、手背、指丫、指甲—带酒精棉花团拍打指甲）进行擦拭消毒，并将此棉花团带入接种箱，用其擦拭接种钩、打火机，用打火机点燃酒精灯，然后将接种钩放在酒精灯上烤3-5秒钟（用酒精灯外焰烤），如烤后温度过高，须放冷却后再用。

（6）用旋转棉花塞的方式打开母种试管，解开栽培料袋，用接种钩从母种试管内切取拇指般大小的已长有羊肚菌菌丝的培养基放入盛有空白培养料的菌种栽培袋中，然后将接好种的菌种栽培袋用原来绳子系好、系紧（可打死结），竖直放在接种箱内一侧后，即可同样方法对其他的空白菌种栽培袋进行接种，直至接完为止。

（7）全部栽培袋均接好后，熄灭酒精灯，将接好种的菌种栽培袋放置在接种箱内5-6分钟后，打开接种箱，取出所有物器，将接好种的菌种栽培袋放置于常温条件下（25℃以下，最好是18-20℃）培育5-7左右，菌丝会长满栽培袋内上部培养料面一圈（袋子上部布满菌丝）即可将其倒扣于栽培地里（用刀沿着袋内培养料上部切开菌种袋，按1平米两袋的量将二次裁培种倒扣于栽培地里，待袋内菌丝全部长满后即可将其除去——如期间袋即有杂菌感染或长虫的要立即去除）。

（8）菌丝生长情况的观察、取舍保存（参见原种接种部分）

母种接种二次栽培种可达100%（主要是看消毒关），一般一支母种可接得5-7袋二次栽培种。

（9）感染杂菌、长虫子的二次栽培种要及时处理掉。

五、播种

1、播种气候条件:每年10-12月份,气温在25℃以下播种，阴天进行为宜,北方应在结冻、前两个月播种；

2、土壤（质）要求：不能是盐碱地、沙漠，泥土PH值应在6-7.5之间为宜，最好是选择稻田，利于保湿（稻田保水性好），林下或菜土亦可，播种前需用水泡以利除虫害、保湿等；选择播种地要接近水源。

3、播前需整好地，即先按每亩10斤（不可多放）的生石灰（防虫害）均匀地播撒在田里，用旋耕机旋耕或其他方式翻土，将土弄碎弄细（但不可太碎），翻土10公分即可，尽可能把地弄平整。

4、地块弄平整后，即可开行做垄（起长垄以提高土地利用率），垄宽（菌床宽）1.3-1.5米为宜，另开宽20cm、深20cm的长沟作日后排水、灌溉用（坡地要顺坡开沟）。

5、播种：先将所用的栽培种从菌种瓶中用接种钩全部刮入干净的容器内，用工具在地垄（菌床）上开6—8公分深的沟（南方6-7公分为宜），即可将栽培种均匀的播撒到沟里，然后再并排开第沟，用开第二条沟的泥土覆盖上第一条沟，如此类推，直至播完。如果种的面积大，可以将地翻平，将种子撒上，再翻一次土将栽培种覆盖上即可。

6、一般一瓶栽培种可播得1.2-1.5平方米的地。

7、播完后要保水，使土壤含水量控制在65%为宜，可用洒水壶均匀喷洒浇水；亦可用漫灌的形式浇水：即将水放入原先开的水沟里，当沟内的水面与床面平齐时（20 cm高）即停，然后让水自然漫浸到菌床内即可。平时注意观察土表，如有泥土泛白现象即说明缺水需要淋水。一般播种前控制好了土壤湿度，播后半个月可不用理会。

8、播好种好，立即搭架遮阳网（北方冬天特别冷需加一层塑料薄膜，但出菇前必须撤掉薄膜；雪大的的地方下雪前亦要撤掉遮阳网和薄膜，雪停后再盖上），遮阳网规格为6针，遮光率为95%，所搭的架子高度适宜（高1.8-2米,宽8-12米）,各棚加间要开深沟排水，同时需用泥土深埋遮阳网边。

9、二次栽培的播种：当栽培种下播到地里20-30天后，地面长出菌丝，就可开始将二次栽培种袋（二次栽培袋的菌比长满袋口一圈即可）的袋口割开（沿袋内培养料上部割开）并倒扣于栽培地里，每平方米1-2袋（主要看地表菌丝的生长情况定，疏时多栽，密时少裁），一亩用300袋左右。待二次栽培袋内菌丝长满袋后即要移除二次栽培袋，但期如果二次栽培袋内长有白色虫子时，应立即移除。

六、播种后的管理

1、主要一个工作是做好土壤的保湿工作，要随时保持土壤的湿度控制在65%。

2、做好防虫、防鼠害工作，防鸟、鼠吃食菌种，人、畜践踏，特别是在出菇、长菌丝期间，不得让人进入遮阳棚内；草害情况：一般不用理会，如实在太多，可人工除草。

3、切记不可施用化肥农药！

七、出菇管理

1、泥土湿度控制在65%，一定在确保通风（空气流通，出菇需大量氧气）；

2、避免人、畜踩踏；

3、一般播种后3-4个月即会出菇（出菇时间与当地气温有关），出菇后7-15天左右即可采收（12-15 cm左右，菌帽散开前采收），采收方法：手捏菌柄左右摇动即可采下，不要把泥脚拔起来，以免污染羊肚菌，按大小分别放入篮内（以免挤压受损），采收要小心，以免伤到其他幼小羊肚菌。大致可出3批菇，持续1个月左右，当气温达22℃以上即停止出菇。

4、采收后，不能用清水洗，直接用小刀（剪刀）去掉菌脚即可。

5、新鲜羊肚菌采回后可装入保鲜袋置于冰箱内存放（冷藏）3天，一般采回后应立即烘干（一小时即可），或用竹条穿成串放在通风处阴干即可（一至两天即可，品相比烘干稍差），烘干、阴干后装袋保存。

6、出菇时如有虫害——蛞蝓（鼻涕虫），可用10的石灰水或10%的盐水喷。

八、其他重要提示

1、克隆、转管扩繁、接种原种、栽培种的过程一定要消毒彻底，用高压灭菌锅灭菌消毒时，一定要有人值守看表、调火候，一定要遵守安全操作规程（拧紧镙母时一定要对角拧）。

2、原种、栽培种、二次栽培种的培养料配方要灵活动用，如条件有限，二次裁培种的培养料可与原种、栽培种的一致。

3、荒地有草过多，播种前可用药物进行除草。

4、接种箱内完成一批接种（克隆或转管等）后，还需要继续接的，须重新消毒后再接种。

5、火烧过后的林地（河边），次年长出的羊肚菌最多！

6、一代母种转管扩繁时，母种试管内培养基前部1cm要去除。

7、作试管或菌种瓶的棉花塞不可粘到培养基或培养料，以免感染。

8、母种因量少，可保存久些，且好保存，原种、栽培种（含二次栽培种）量大，最好现做现用。

9、母种转管扩繁不能超过五代！

10、制作培养基、培养料所用的水一定要测一测其PH值，在7左右为宜。

11、经高温灭菌后的培养基、培养料在常温下可保存2-3个月，但最好是现做现用，待其冷确后放置2-5天即要使用为好。

12、培养料中的小麦配方装瓶或装袋时不用压得过紧，木屑配方可适当装紧些。

13、野生菌种一般在3-6月份进行野外采集。

14、二次播种（起补种、杂交的作用）时，栽培袋的用量要视田地里菌丝的生长情况决定，生长稀疏可适当多栽，反之少栽，因为菌丝生长过多会在后期削弱菌丝的生长！

14、高温灭菌时间宜长不宜短、温度宜高不宜低！

15、用棉花团塞试管或菌种瓶时，宜紧不宜松！

16、克隆、转管、接种（原种、栽培种）均无光照要求，但不能受至阳光直射，菌丝培育时亦无湿度要求。

17、用汽油桶用灭菌具器时，加入的水量应当达到油桶下格的2/3（整桶高的2/9），用木质格栅交叉垒入菌种瓶或菌种袋。

18、接种箱内消毒剂配制药品注入顺序不能乱，先加甲醛，后加高锰酸钾！

19、确定播种时间后，必须至少提前三个月做好有关的工作：提前1个月制好栽培种，在做栽培种之前又要至少提前1个月制好原种，做好原种前，要有足量的二或三代母种来接种原种，即要提前一周左右做好一代或二代母的转管扩繁，转管扩繁前做好克隆出首代母种（或购得母种），这至少又要提前10天左右；二次播种需在栽培种下播到田里20-30天后田里有菌丝长出后进行，而二次栽培种又需要一周的时间进行培育，故二次栽培种要在栽培种下播后2-3周后即进行接种培育。

 

 

羊肚菌裁种流程

野生实体 (3-6月进行采集)

↓克隆

一代母种(经过7-10天的生长)

↓转管扩繁

二代母种(经过大致一周的生长)

↓接种                                    

原  种(经过大致两到四周的生长)                 

↓接种                                       

裁培种(经过大致两到四周的生长)

↓播种

大  田→播种20-30天之后→进行二次播种(播二次裁培种)→两至三周后除去二次裁培袋（菌丝长满袋即除去）

故而要合理安排制种、播种时间，最好先确定好播种的时间后往前推算制作菌种的时间，每一代菌种在3-8摄氏度的温度下最长可保存3个月（超过三个月会影响其活力和品质等）。

以上内容是同朱斗锡老师的学员们聊天记录整理的,对培育羊肚菌有一定帮助.我认为改用液体菌种生产,再配合我们河南模式,羊肚菌生产一定会成功.我作为研究所的一员,愿将此份资料献给大家,供大家参考.希望同道者看后,多提宝贵意见.

整理者:河南省鲁山县赵村乡中汤新村 李国强

联系方式:QQ:1315801842.电话:03755768138.手机:13525390772.2020年9月手机：17814955117